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    烈冰助力||单细胞RNA测序鉴定半月板祖细胞并揭示半月板退变机制 时间:2020-01-07


    半月板在关节稳定、减震、接触力分布和关节润滑等方面起着重要作用,其包含不同的细胞类型,主要包括软骨细胞形态细胞和纤维细胞形态细胞。然而,半月板的细胞类型组成、分布和相应的生物标志物,以及治疗半月板退变的生物靶点仍不清楚。

    2019年12月7日,中山大学附属第一医院廖威明教授课题组和张志奇教授课题组通过ScRNA-Seq详细描绘半月板的细胞组成,鉴定出一种在半月板组织工程中具有应用前景的祖细胞,并证明了半月板的退变机制。并且通过TGFβ1治疗有效缓解半月板退变提出一种半月板退变的潜在治疗策略。此次研究工作中的单细胞RNA测序实验与数据分析由烈冰科技参与支持。该研究成果以“Single- cell RNA- seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration”为题发表于《Annals of the Rheumatic Diseases》(IF=14.299)期刊。


    分析思路:

    测序样本信息:

    健康半月板样本、退变半月板样本

    测序平台:

    BD Rhapsody系统

    测序数据量:

    100G


    研究结果:

    1. ScRNA-Seq揭示健康人半月板的细胞组成类型

    研究者首先对健康人的半月板组织进行ScRNA-Seq,对3639个细胞进行t-SNE分析,共分出7个亚群,其中包含两个新发现的细胞亚群

    ①    内皮细胞(EC);②软骨细胞祖细胞 (CPC);③调节性软骨细胞(RegC);④纤维软骨细胞(FC);⑤预肥大软骨细胞(PreHTC);⑥纤维软骨细胞祖细胞(FCP);⑦增殖纤维软骨细胞(ProFC)。并进一步通过免疫组化来确定各细胞亚群的分布,FCP主要分布于半月板表面,RegC在半月板中部,EC存在于红区血管周围 ,而PreHTC分布于白区。

    图1 健康人半月板的单细胞图谱


    2.健康人半月板细胞的分化轨迹分析

    研究者通过拟时序分析发现FCP和EC存在于分化轨迹的起始处。为了进一步探究FCP是否具有祖细胞的性质,根据高表达基因分选出CD146+原代半月板细胞,并对其进行分化和克隆能力的验证。通过集落形成和多向分化潜能分析实验验证CD146+细胞可以向成骨细胞和脂肪细胞分化并形成集落。提示在健康人半月板细胞中,FCP具有祖细胞的特性。

    图2 人半月板祖细胞的鉴定

    为了研究FCP的分化轨迹,研究者选取了FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC重新构建了一条新的分化轨迹(图3A)。轨迹起始部位由FCP和ProFC组成,其后为PreHTC,而末端Fate 1为FC,末端Fate 2由RegC组成(图3B)。进一步分析FCP向 Fate1和Fate2分化过程中各亚群细胞基因表达模式(图3C、3D)。

    为了确定细胞分化轨迹,研究者分析了各亚群细胞的差异表达基因及表达模式,并研究了体内半月板发育过程,观察1、2、3、4、8、26和52周小鼠半月板中marker基因的表达情况(图3E):COL1A1出生后表达逐渐增强,在4周时达到高峰,随后表达量逐渐降低;MYLK在3周后,表达量显著下降。体内实验的基因表达趋势与测序分析得出的趋势相一致,进一步验证了FCP的分化轨迹。

    图3 FCP分化的单细胞轨迹分支点分析

    3.健康人群半月板与退变半月板单细胞图谱的对比分析

    研究者首先通过观察组织结构变化,发现退变半月板的胶原纤维结构紊乱(图4A)。然后对健康和退变半月板进行ScRNA-Seq分析(图4B-E),发现退变半月板的各细胞亚群占比发生显著变化,并发现三个新的亚群:(1)单核细胞来源的树突状细胞(MoDC);(2)肥大软骨细胞(HTC);(3)退变半月板祖细胞(DegP)。

    图4 健康人半月板与退变半月板单细胞图谱的对比分析


    4. 单细胞分化轨迹提示DegP是半月板退变的关键因素

    研究者通过集落形成和多向分化潜能分析实验发现DegP(CD318+细胞)可以形成集落并向多种细胞分化,证明在退变半月板中,DegP具有祖细胞特性。因此,研究者重新选取FCP、ProFC、CPC和DegP四个亚群来构建分化轨迹,轨迹起始端主要由FCP和ProFC组成,Fate 1和Fate 2分别由DegP和CPC组成(图5A、5B)。

    通过比对健康与退变半月板的命运分支点基因表达情况,发现在半月板的退变过程中,FCP向DegP的分化是异常的细胞状态(图5C、5D)。研究者对此采用免疫组化染色实验证实DegP标记基因(GAS1、DNER)在半月板病变且细胞增殖的区域显著高表达(图5E)。

    此外,研究者还利用IL-1β分别刺激健康和退变半月板细胞,得到相似的结果:CD146+细胞减少和CD318+细胞增加,提示促炎介质IL-1β诱导DegP活化是半月板退变的机制。

    图5 单细胞分化轨迹提示DegP是半月板退变的关键因素


    5. TGFβ信号通路的激活可以抑制退变半月板CD318+细胞的增加

    由于TGFβ信号通路激活后会增强半月板干细胞的分化能力。研究者观察到在健康半月板细胞中TGFβ信号通路被上调,而且其配体TGFβ1显著高表达(图6A-D)。因此,研究者利用TGFβ1体外刺激退变半月板细胞,发现CD318+细胞数量明显减少、COL1A1(FCP标记基因)表达量增加(图6E、6F),提示TGFβ可能有延缓半月板退变的作用。

    图6 TGFβ信号通路的激活可以抑制退变半月板Cd318+细胞的增加


    综上所述,研究者通过使用ScRNA-Seq全面描绘了健康及退变半月板细胞的图谱,并确定了在半月板组织工程中具有重要意义的CD146+祖细胞。其次,研究者还证实了促炎介质诱导DegP活化是半月板退变的可能机制,TGFβ可以减少DegP的比例,这可能成为延缓半月板退变的治疗策略。



    原文链接:

    http://dx.doi.org/10.1136/annrheumdis-2019-215926

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